‘壹’ 质粒转化步骤
质粒的转化，满满干货
原理：在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后，受体细胞的膜通透性发生改变，质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子，进入到细菌体内而实现扩增。
感受态细胞：是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。在基因工程中，用于转化的受体菌（Restriction-Modification 缺陷变异株，以防止对导入外源DNA进行切割）一般通过诱导的方式实现。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。
质粒的转化主要包含
Ⅰ感受态细胞制备
Ⅱ质粒DNA转化
Ⅲ质粒DNA的提取
（Ⅰ）感受态细胞制备
1）从新活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2）将该菌悬液按照1:100转接到液体培养基中，100ml，37℃振荡扩大培养，2~3h。当培养液开始浑浊时，间段性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。
3）培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20min，0℃-4℃离心10min（4000r/min）。
4）弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。
5）加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30min。（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率）
6）4℃离心10min（4000r/min）。
7）弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。
8）可直接用于实验，4℃保存。也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。
（Ⅱ）质粒DNA的转化
1）取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒1ul DNA混匀,同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。
冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最后一点冰融化后，迅即加入DNA. 解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。
2）冰浴30min，离心管放到42℃保温90s（不要摇动离心管）。冰浴时间短于30min ,可能影响转化率。然后迅速冰浴2min。
3）向离心管加800ulLB液体培养基，37℃振荡培养1h（150r/min）。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。
4）取适当（50ul）的复苏细胞培养液，涂布在含抗性的选择性培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30min。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中，培养12~16h，出现菌落。
5）菌落结果：
① 无菌落
失败或者培养条件不充分
② 布满菌落,
呈苔样，失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致
③ 布满菌落
浓度太高，失败
④ 出现菌落
符合要求
Ⅲ）质粒DNA的提取
质粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒，实验操作简单，只需按照产品操作说明操作即可。不过对于其中主要试剂和作用的理解，能够避免实验过程中的一些问题，或者能够更好的解决问题。
各厂家提供的试剂盒中试剂不尽相同，一般的提取纯化试剂盒，主要包括以下试剂：
A. 细胞悬浮试剂: 主要作用是将菌体细胞悬浮起来。菌体悬浮不完全会导致裂解不完全，质粒的提取纯度和得率都会下降。通常需要在里面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常选用Tris-HCl作为体系中pH稳定缓冲液。EDTA，金属离子螯合剂可以和细菌体内的金属离子结合而DNase的活性受到抑制。有的会有葡萄糖，可用来增加溶液粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉淀时间。
B. 细胞裂解试剂：主要作用是裂解细胞，通过碱溶液的作用破坏细胞膜结构，使其双层膜结构改变，而导致细胞裂解。一般由一定浓度的NaOH和SDS组成。SDS的作用与后期中和过程中清除掉蛋白质等细胞杂质有关系。此步骤中需要注意的是，碱溶液的作用时间不能太长，也不可剧烈离心管，反之会导致碱破坏基因组DNA，导致同等大小的基因组DNA被提纯，造成污染。
C. 中和试剂：主要作用使中和掉细胞裂解试剂中的碱性物质，并去除掉其中的蛋白等杂质物质。组份有醋酸钾和醋酸，或者乙酸钾和冰乙酸。
D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多余的盐离子。DNA被试剂盒中的提取柱吸附之后，需要用wash buffer 洗脱掉多余的盐离子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇对后续酶切和测序反应会有影响，因此在后续洗脱DNA前，必须完全清除柱子中的乙醇。
E. 洗脱Buffer: 主要作用就是洗脱硅胶柱上的DNA样品。
1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通过重力的作用，使平衡buffer都流出。
2.细胞收获：对于高拷贝质粒（培养液中，>2µg DNA/mL)，吸取1-3ml培养液,离心去上清；对于低拷贝质粒（培养液中，<2µg DNA/mL)，吸取10-15ml培养液，离心去上清。
3. 细胞悬浮：加0.4mL的细胞悬浮液(containing RNase A)悬浮细胞，并使其混匀。
4. 细胞裂解：加入0.4mL细胞裂解液，通过上下颠倒带盖子管子5次使其轻轻混匀，不要涡旋，之后在室温下放置5min.
5. 中和：加入0.4mL的中和试剂，立即混合均匀。当大的细胞颗粒被处理后，可能会进行更剧烈的摇动。但是，不要涡旋！~12,000xg离心混合物10min. 如果是采用的4°离心，上清液需要恢复到室温，再加入到柱子中。
6. 装柱：吸取步骤5中的上清液到平衡柱中。让混合液通过重力的作用流出，弃掉流出液。
7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脱柱子量次。每次清洗让清洗液通过重力的作用流出，弃掉流出液
8. 质粒DNA洗脱：加入0.9mL的Elution Buffer。让Elution Buffer通过重力的作用流出。不要强行弄出里面的液体。
9. 质粒DNA沉淀：加入0.63mL异丙醇去析出，混匀，~12,000xg at/4°C离心30min。小心的去掉上清，之后风干10分钟
10. DNA纯化：将管子中的DNA溶解到TE buffer中。将这些溶液转移到新管中。
重组质粒鉴定的方法：
① 双酶切后跑电泳；直接DNA电泳可判断整个DNA重组质粒是否正确。② PCR(插入片段在2kb以下时)，然后电泳。
③ 送公司测序（最为准确的鉴定方式）。
影响转化效率的因素：
① 细胞状态和细胞密度: 培养菌最好选用传代次数少，且保存于-70℃或者-20℃。不要使用经过多次转接或者保存于4℃环境中培养菌。细胞生长密度以刚进入对数其为最好，可通过检测培养液的OD600值来判断，密度过高或者不足，都会影响转化效率。通常DH5α菌株在OD600的值为0.5左右，细胞密度在5*107个/ml左右比较合适。密度过高或者不足均会影响转化效率。
② 质粒的质量和浓度：转化的质粒DNA中，超螺旋状态的质粒，转化效率最好。在一定浓度范围内，转化的效率与添加质粒的浓度成正比。不过在添加的质粒的量和体积过大的时候，转化效率也会降低。质粒的分子量越大，通常来说转化率也会降低。
③试剂的质量：转化过程中所用的试剂，如氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率。
④防止杂菌和DNA污染：实验需要在无菌条件下进行，所用的仪器和试剂均需要灭菌处理，并防止在实验过程中引入其他污染。
⑤培养过程的条件：培养瓶中培养基的量关乎到菌体生长过程中的能量代谢。通常来说厌氧环境做出来的感受态的转化效率较低。建议500ml三角瓶液体培养基量不超过100ml, 250ml三角瓶液体培养基量不超过50ml. 培养基的pH值要适宜，接种前一般pH值在6.8-7.2，等培养结束后可以再测一下pH值最好在6.5以上（不低于6.0），表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。培养基中的各种离子和温度，也对形成好的感受态有关系。
几种扩增常用感受态细胞：
① 普通骨架载体cDNA产品
DH5α：常用于质粒克隆，可用于蓝白斑筛选
TOP10：适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能够保证高拷贝质粒的稳定遗传。
TG1: 生长速度快，常用于噬菌体的制备，同时也可用于普通质粒的构建。
CopyCutter：适用于有毒克隆。
② 慢病毒载体质粒：
Stbl3: 是慢病毒载体系统推荐使用的菌株，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率
Stable（NEB）：可用于逆转录病毒/慢病毒载体系统扩增。
‘贰’ 重组质粒 DNA 的转化实验时为什么先正置,后倒置
正置的原因是你本来涂板抹开了，但是你没有抹干，如果直接倒置会引起一体流动，结果你会发现，一大堆菌落挤在一起，你没有办法挑单克隆，你会痛不欲生的。在烘箱中正置30分钟是为了烘干液体，防止上述情况发生。而倒置是为了防止，细菌由于重力作用向培养基里面发展而非向上发展哦~
‘叁’ 关于重组质粒转化的问题
可能是特定的热稳定DNA聚合酶作用的最适温度及时间吧。扰动转化体系的话，可能由于解链与复性过程中DNA分子的不稳定，会导致拷贝扩曾出现异常吧。
‘肆’ 微生物的扩大培养为什么要得到由单个细胞繁殖而来的菌落呢
有时单菌落很多次，你可以从单细胞繁殖，它必须重复分离纯种的方法有很多你第一次面临着非常全面的，可以看看。
微生物实验室分离纯化方法日期:2010-03-01浏览次数：18
混合微生物种群仅包含某一种或一个微生物过程称为微生物的分离和纯化。在分子生物学的研究和应用，不仅
只包含一个特定的方法或微生物的过程称为微生物的分离和纯化，混合微生物种群中分离。在分子生物学的研究和应用，不仅通过混合的天然微生物的分离和纯化技术分离出特定的微生物，但也一定要注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，以防止其他微生物的污染。
1，与固体培养基中分离和纯化
单个微生物的合适的固体介质的表面或内部生长，繁殖，在一定程度上，可以形成可见的，是一个一定的形态结构的子细胞生长组称为菌落。即使当表面的固体培养基许多菌落到细菌的草坪成为此。不同的微生物的生长和形成的菌落在一个特定的介质或细菌草坪通常有稳定的特点，可以成为微生物的分类和鉴定的重要依据。大多数细菌，酵母，以及许多真菌和单细胞藻类，形成孤立的固体培养基上的菌落，用一个合适的片剂分离方法是很容易获得的纯培养。所谓的平面，即培养板中提到的，它是指在固体培养基倒入无菌的陪替氏培养皿中，并冷却和固化后，盛固体培养基平板。此方法包括一个单一的分离微生物，并固定在固体培养基的表面或内部的。固体培养基凝固与琼脂凝胶材料中，每一个独立的活微生物的生长，繁殖，形成菌落，菌落形成可移植的。最常见的分离，培养的微生物琼脂固体培养基上是一个坚实的中小板。容易被科克成立100多年来，一直是最常见的手段的不同菌株板分离微生物纯培养。
1.1稀释倒平板法
第一个微生物悬浮液了一系列的稀释（如1:10,1:100,1:1000,1:10000），然后稀释剂一点，并已熔化和琼脂培养基冷却至50℃或约混合，振摇后，倾入消毒的陪替氏培养皿，直到在琼脂凝固后，使细菌的琼脂平板中，并培养一定的时间，可能会出现的菌落。如果稀释适当地在平坦的表面上出现或琼脂培养基中，可以分散的单个菌落，菌落可能传播由细菌细胞中，就形成了。然后挑取单个菌落，或重复以上操作数次，就可以得到一个纯粹的文化。
1.2扩展板的方法可以很容易地导致死亡的一些热敏感的菌株，并利用微生物悬浮液加入热介质，然后倒平板电脑也导致一些稀释倒平板法严格的需氧细菌缺乏氧气由于固定在琼脂中间影响其生长，因此纯种的分离方法是微生物学研究的扩散板方法中使用。其做法是第一熔融培养基倾入无菌的陪替氏培养皿中，以制备无菌的片剂，冷却和固化后，一定量的微生物的悬浮液逐滴加入到在平板表面，然后作为一个无菌玻璃从整个板的表面均匀地分散涂布棒杆菌，拾取单个菌落培养后（图1）。
图1扩展板的方法
1.3平板划线法
最简单的方法分离的微生物平板划线法，即接种环无菌精选小料要分开的连续划线无菌平坦面（图2），微生物细胞的数目将减少与划线的数目增加，并且逐渐分散，如果越过如果合适，该微生物可以11分散后的培训，上述平面板的表面上，得到单菌落。有时单菌落，它必须重复多次，然后才能得到纯种分离的单细胞繁殖。其原理是，微生物的样品多次的固体培养基的表面达到分离的目的，从点到线“稀释”。划线的方法很多，常见的容易出现的单菌落划线的斜杠法曲线法，网格法，辐射，四格的方法。
图2平板划线法
1.4稀释摇管
固体培养基分离严格厌氧菌的特殊性，，如果机体暴露在空气中立即死亡，可以准备通常的方法平板，然后放置在一个封闭的容器中培养，并在容器中的氧气可以是化学，物理或生物的方法来清除。对于那些谁是更敏感的氧厌氧微生物纯培养，分离培养法都不能动摇稀释管，它是另一种形式的稀释倾注法。管加热的第一串联盛无菌琼脂培养基琼脂熔化后，冷却并维持在50℃左右，梯度稀释的材料，可以与这些管分离，管快速摇动均匀，冷凝后，在琼脂表面倾倒灭菌的液体石蜡和固体石蜡，介质和空气的混合物的柱层被分离。培养后，形成的菌落在琼脂上在中间的列。挑取单菌落，移植，需要使用无菌针头盖和用毛细管插入琼脂和它们之间的壁进入无菌无氧气体中除去液体石蜡 - 石蜡，琼脂柱吸出，放置在陪替氏菜用无菌刀琼脂柱切成薄片观察和殖民地移植。
2，用液体培养基中分离和纯化
大多数细菌和真菌分离使用的板方法通常是令人满意的，因为它们是在固体介质中的大多数物种上看起来很不错。然而，迄今为止，不是所有的微生物，可以在固体培养基上生长，例如，一些大的细菌的细胞，许多原生动物和藻类等，这些微生物需要使用液体介质中分离，得到的纯培养。使用液体培养基中分离和纯化的
稀释法。在液体培养基中，接种物的顺序稀释以获得高程度的稀释效应，少于一个微生物是在试管中分配。大多数的管子，如果稀释后没有微生物的生长，并在体外培养中得到的微生物的生长可能然后有一个纯培养。稀释后管的比例将大幅增加微生物的生长，获得纯培养的降水。因此，稀释法，固液分离，必须在许多平行试管稀释，大部分（一般应不超过95％）表明没有增长。
3，
分离的单细胞（孢子）只能从该总数的类型的混合微生物种群的优点是被隔离的稀释方法的一个重要的缺点。在自然界中，许多微生物在混合组是少数。在这种情况下，您可以采取的显微切割法直接分离细胞或单个个体进行培养，获得纯培养物，被称为单细胞（或单孢子）分离方法，从一个混居的。单细胞分离难度和细胞或个人的大小成反比，较大的微生物，如藻类，原生动物更容易，个别的小细菌是困难得多。的
较大的微生物，可以使用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌介质转印洗涤数次除去较小的微生物污染。此操作可以在低倍率的显微镜进行，如在解剖显微镜下。相对小的单个微生物，需要在显微镜下使用显微操作使用毛细管或微观的针，钩，环拾取一个单一的微生物细胞或孢子，得到纯培养。在显微镜下的显微操作在没有单细胞分离，也有一些替代的方法可以使用??，例如，可以通过适当稀释的样品制备后成小液滴，在显微镜下观察到的，并只选择一个单元格含有液体纯培养分离。分离的单细胞操作技术有更高的要求，使用大多限于高度专业化的科研。分离
4，选择培养的培养基或培养条件没有能够满足所有的微生物的生长的需要，所有的培养基中选择在一定程度上性质。如果在某种微生物的生长需要是已知的，可以设计适合于该微生物的生长的特定的环境，从而能够以该微生物选自混合微生物种群进行培养，虽然在混合微生物种群种微生物可能是是少数。等的分离，在被称为选择培养分离，特别是适合于从自然界分离的，找到有用的微生物的微生物的纯培养的技术通过选择培养。自然，在大多数场合中的微生物群落是由各种各样的微生物，分离所需的特定的微生物是非常困难的，尤其是当存在时相比，以非常小的其他微生物的量和一定的微生物种，单用途板在一般的稀释方法几乎是不可能的。这种微生物的分离，必须基于的特性的微生物，包括营养，生理，生长条件，培养菌株。或抑制大多数微生物不能生长，或造成这种微生物的成长环境，有利于社区的数量的增加，因此，在一定的时间来培养板稀释的纯培养??分离细菌。
4.1使用在选择平板
直接分离，根据被分离微生物功能选择不同的培养条件下，也有各种方法可以使用??。要分开，例如，嗜热菌，可以在高温条件下培养;分离某些抗生素的耐药菌株，并用抗生素，可以分离成板，一些微生物，如螺旋体，粘细菌，蓝藻等在的琼脂平板的表面。或的士车厢内，他们可以利用的滑动特性的分离和纯化，因为滑行可以让自己和其他微生物不能单独移动。板的微生物群落，使微生物在跑道上滑行滑行前挑接种反复进行，以获得一个纯粹的文化。
4.2富集培养
富集培养的原则和方法是很简单的，不同利用不同的微生物的生命活动的特点，制定具体的环境条件下，唯一的条件相适应的微生物强劲的增长，它在社会上，可以很容易地分离到所需的特定微生物数量大大增加。富集条件可以根据需要分离的物理，化学，生物，和集成的许多方面，如温度，pH，紫外线，高的压力，光，氧气，营养等许多方面的微生物的特性选择。在相同的培养基和培养条件下，它是容易反复移位的物种的菌株后，在固体培养基上生长，并最终浓缩的单个菌落。如果你想分开一段寄生菌的样品接种到相应敏感宿主细胞群体，有很大的增长。通过反复移动的物种可以得到纯寄生菌。
5，二元文化
分离，得到纯培养的目的。然而，在某些情况下，这是很难做到的。但可用的二进制文化作为替代品的纯化和培养。文化包含两个或更多种微生物混合培养作为一个已知的，并仅含有2种微生物的培养，但也有是同时保持意识文化称为二进制文化之间的特定关系。如二进制文化是最有效的方式来保存病毒，因为病毒是细胞生物的严格细胞内寄生。有些细胞和微生物也有严格的生物细胞内寄生物，或特殊的共生关系。这些微生物，二元文化是最接近的纯培养物的培养方法，在控制的条件下，可以在实验室中实现。此外，原生动物大鳄微小的微生物很容易在实验室培养的方法与双文化，文化的微生物原生动物和狩猎。例如，纤毛虫，变形虫和粘菌。
几种方法如上所述，平板分离方法一般用于实验室微生物的分离和纯化。在固体培养基上的单个菌落的微生物的生长和形成，通常是由一个细胞组件制成的复制品。单菌落被选中，并获得一个纯粹的文化。可以通过稀释涂布平板或板裸奔技术的方法，以获得单个菌落。值得注意的是，通过在平板上生长的单个菌落，分离从微生物种群不一定可以保证的纯培养。因此，纯文化的决心，除了观察菌落特征，但也与显微镜检查，以确定个体的形态特征，一些纯培养的微生物通过一系列的分离和纯化过程，以及各种特性，以获得。
‘伍’ 重组质粒的连接、转化及筛选实验方法的实践谁能总结一下，我写生物论文需要了解一下这方面的知识
生物帮，依托互联网，在注重科学性、实用性和权威性的前提下，面向生物研究者、企业和研究机构，提供最新、领先、精准、高效、全面的生物产品和技术信息。楼主可以去那里查看一下啊。 [实验要点总结]1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段(2-5倍)，这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。6、LB选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。8、在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。 如果有空的话可以去生物帮（ MALINGS.www.bio1000.com/ ）那里看下，实验的步骤，细节，以及注意事项，都有介绍的
‘陆’ 基因工程中重组质粒怎么形成
在基因工程中，通常是把外源DN***断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。
载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。目前，将外源基因运送到原核生物细胞的载体研究的较多，运送到植物和动物细胞中去的载体还处于探索阶段。本章以原核细胞载体为主，讨论各类载体的结构、功能以及构建过程。
在基因工程中所用的载体，主要有5类，
(1) 质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒。
(2) 噬菌体的衍生物。
(3) cosmid(柯斯质粒)。
(4) 单链DNA噬菌体M13。
(5) 动物病毒。
各类载体的来源不同，在大小、结构、复制等方面的特性差别很大，但作为基因工程用的载体，以下三方面是它们共有的特性和基本要求： (1)在宿主细胞中能独立自主的复制，即本身是复制子。(2)容易从宿主细胞中分离纯化。(3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。各类载体具有自己独特的生物学特性，可以根据基因工程的需要，有目的的选择合适的载体，为此，分别介绍各类载体。
一、质粒载体
质粒是一种裸露的，比病毒更简单的，有自主复制能力的DNA分子，是处于生命与非生命的分界线
(一) 质粒的一般生物学特性
质粒（plasmid)是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。目前对细菌质粒研究的较为深入，在基因工程中，多使用大肠杆菌质粒为载体。质粒分子的大小为1—200kb，质粒和病毒不同，它是裸露的DNA分子，没有外壳蛋白，在基因组中，也没有溶菌酶基因。质粒可以‘友好”的“借居”在宿主细胞中，也只有在宿主细胞中，质粒才能完成自己的复制。同时将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达，赋予宿主细胞各种有利的表型。
1．质粒的类型
在大肠杆菌中现已找到许多类型的质粒，其中对F质粒，R质粒和Col质粒研究的较为清楚。由于这些质粒的存在，寄主细胞获得了各自不同的性状特征。简介如下：
F质粒：又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。 F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须(pilus)的结构，它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌—雄细胞配对。我们称这种过程为细菌的接合作用(conjugation)。在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中的F因子按滚环复制模式，经性须作用进入到雌性细胞。配对之后F—受体细胞获得了F因子，也变成为F+细胞。
F因子不但能够通过接合作用实现自我转移，而且还能够带动寄主染色体一道转移。由F因子整合到染色体而成的Hfr细胞（高频重组细胞），就有可能引发寄主染色体发生高频转移。但F因子的这种整合作用是一种可逆的过程，因此在一定的条件下，Hfr细胞又可重新变成F+或F细胞。
R质粒：也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力
Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。
根据质粒DNA中是否含有接合转移基因，可以分成两大类群:即接合型质粒和非接合型质粒。接合型质粒亦称自我转移的质粒，这类质粒除含有自我复制基因外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因，如F质粒，部分R质粒和部分Col质粒。非接合型质粒亦称不能自我转移的质粒，此类质粒能够自我复制，但不含转移基因组，因此这类质粒不能从一个细胞自我转移到另一个细胞。从基因工程的安全角度讲，非接合型质粒用作克隆载体更为合适。
2．质粒的复制类型
一种质粒在一个细胞中存在的数目，称为质粒的拷贝数。根据宿主细胞所含拷贝数的多少，可把质粒分成两种不同的复制型。一种是低拷贝数的质粒，称“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid)，此类质粒每个宿主细胞仅含1～3份的拷贝。另一类是高拷贝数的“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)，这类质粒每个宿主细胞可达到10～60份拷贝。
一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的，这往往同宿主的状况有关。同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型，这说明质粒的复制不仅受自身的制约，同时还受到宿主的控制。
在一般情况下，质粒的接合转移能力与复制型及分子大小间有一定的相关性。现归纳如下：
分子量大 分子量小
接合型质粒 拷贝数少 非接合型质粒 拷贝数多
严紧型复制 松弛型复制
3．质粒的不亲和性
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性(plasmid incompatibility)，也称不相容性。例如colEI派生质粒，它们之间是互不相容的，也就是说，这些亲缘关系较近的不同质粒，当两种进入同一细胞后，必定有一种在细胞的增殖过程中，被逐渐排斥(稀释)掉。称这些质粒间是不相容的。
彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群Gneompatiblity group)。而彼此能够共存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。它们之间是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。
(二) 质粒载体的基本条件
以上讨论的都是天然质粒，天然质粒的研究在理论上和遗传学等方面作出了贡献，但它很难直接作为基因工程的运载体应用。质粒载体绝大多数是以天然质粒为基础，人工改造和组建形成的实用载体。可根据不同的实验要求，加以选择。
作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件：
(1) 能自主复制，即本身是复制子
(2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；
(3) 在基因组中有1—2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。
(4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。
二、 大肠杆菌质粒载体
1．pBR322质粒
质粒pBR322是经人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，亦是应用最为广泛的克隆载体，利用pBR322曾克隆到多种基因，虽然现在已有多种具有更优良特性的新型克隆载体逐渐代替了pBR322在基因克隆中地位，但pBR322仍是人工构建的具有几乎所有的理想特性的基因克隆载体之一。pBR322质粒是按照标准的质粒载体命名法则命名的。“p”表示它是一种质粒；而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F．Bo1ivar和R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母，“322'’系指实验室编号，以与其他质粒载体如pBR325，pBR327，pBR328等相区别。当然，“BR"恰好与“细菌抗药性”(bacterialresistance)两个词的第一个字母等同，所以有不少人认为pBR322中的"pBR"是“细菌抗药性质粒”的英文缩写。这显然是一种容易使人信以为真的猜想，而事实上只是一种有趣的巧合。
（1）pBR322质粒的结构
pBR322的图谱:
从pBR322质粒的构建过程，可以知道它是由三个不同来源的部分组成的，
第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；
第三部分来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。
（2）pBR322质粒载体的优点
pBR322质粒载体的第一个优点是具有较小的分子量。为了方便起见，大家统一规定pBR322质粒DNA分子核苷酸的计数从EcoRI限制酶的识别位点开始，并公认该序列…GAATTC…中的第一个T为核苷酸1(图4—23)，然后沿着从tetr基因到ampr基因按顺时针方向顺序计数。因此pBR322质粒DNA分子的正确长度是4 363bp。
pBR322质粒载体的第二个优点是，具有两种抗菌素抗性基因可供作挂化子的选择记号。现在已知总共有24种核酸内切限制酶对pBR322DNA分子都只具有单一的识别位点。其中有7种限制酶：EcoRV, NheI, BamHI, SphI, SalI, XmaIII和NruI，它们的识别位点是位于四环素抗性基因内部，另外有2种限制酶:ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr基因的失活；还有3种限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨苄青霉素抗性基因（ampr）内具有单一的识别位点，在这个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。这种因DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。
质粒DNA编码的抗菌素抗性基因的插入失活效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。例如，将外源DN***段克隆在pBR322质粒的BamHI或SalI位点上，由于阻断了tetr基因编码序列的连续性，而使其失去活性，结果便产生出了具有AmprTetr表型的重组的pBR322质粒。将这样的重组质粒转化给野生型(AmpSTetr)的大肠杆菌细胞，并涂布在含有氨苄青霉素的选择性培养基平板上。那么存活下来的菌落都将具有Ampr的表型，因此它们也必定是获得了编码有这种抗性基因的质粒的转化子克隆。但在这些Ampr表型的转化子克隆中，有一部分具有Tetr表型，另一部分具有Tets的表型。只要将它们涂布在含四环素的选择性培养基平板上，就可以迅速地辨别出它们到底属于什么表型。因为在tetr基因内没有插入外源DN***段的pBR322质粒，其tetr基因是有活性的，由它转化来的Ampr转化子菌落就应该是Tetr的表型，所以AmprTets表型的细胞所携带的pBR322，必定是在其tetr基因上插入了外源DNA的pBR322派生的重组质粒。
pBR322质粒载体的第三个优点是，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。
2．pUC质粒载体
pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5，—端带有一段多克隆位点的lacZ'基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。
(1) pUC质粒载体的结构
此类质粒载体之所以取名为pUC，是因为它是由美国加利福尼亚大学University of California的科学家J．Messing和J．Vieria于1987年首先构建的。
一种典型的pUC系列的质粒载体，包括如下四个组成部分：
（a）来自pBR322质粒的复制起点(ori)；
（b）氨苄青霉素抗性基因(ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；
(c) 大肠杆菌β—半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α—肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ'基因；
（d）位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点(MCS ，multiple cloning sites)区，但它并不破坏该基因的功能(图)。(2)pUC质粒载体的优点
与pBR322质粒载体相比，pUC质粒载体系列具有许多方面的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌克隆载体之一。其优点概括起来有如下三个方面：
第一、 具有更小的分子量和更高的拷贝数
在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多，如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp。同时，由于偶然的原因，在操作过程中使pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致rop基因的缺失。由于该基因编码的共63个氨基酸组成的Rop蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC质粒的拷贝数比带有pMBl或ColEl复制起点的质粒载体都要高得多，平均每个细胞即可达500～700个拷贝。所以由pUC质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。
第二，适用于组织化学方法检测重组体
pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ，基因，在这个基因的编码区中插入了一个多克隆位点。lacZ，基因所编码的α—肽链（编码β—半乳糖酶基因的氨基末端）可参与α—互补作用。这种载体适合于可编码β—半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然质粒和宿主编码的片段各自均无活性，但它们共处一个细胞中时可融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β—半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做α—互补。由α—互补而产生的Lac+细菌易于识别，在诱导物异丙基—β—D—硫代半乳糖苷(IPTG)存在时，它们在含有生色底物5—溴—4—氯—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的平板上形成蓝色的菌落。当多克隆位点中插入外源DN***段时，互补作用遭到破坏，在含有IPTG和X-gal平板上将出现白色菌落。利用“α—互补”进行重组子的筛选比利用“插入失活”法更加方便。应用pBR322质粒作克隆载体，其重组体转化子克隆的选择则需经过两个步骤，即还需从头一种抗性平板转移到另一种抗性平板。由此可见，使用pUC质粒载体进行基因克隆要比pBR322节省时间。
第三，具有多克隆位点MCS区
pUC质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DN***段，可以方便地从pUC质粒载体转移到M13mp8载体上，进行克隆序列的核苷酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI的外源DN***段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上。
3. pGEM系列载体
pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体。在其总长度为2 743bp的基因组DNA中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ'基因。在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。
pGEM系列载体与pUC系列之间主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于lacZ'基因中多克隆位点区的两侧(见图)，故若在反应试管中加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，那么克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。
三、λ噬菌体载体
l．λ噬菌体的一般生物学特性
λ噬菌体为线形双链DNA分子，长度约为49kb，在λDNA分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，当λ噬菌体进入细菌细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点。
λ噬菌体是一个温和噬菌体，其生活周期有二种不同的类型，即裂解周期和溶源性周期。在裂解周期中，λ噬菌体的DNA分子一旦注入寄主细胞中，便可借助于寄主的复制和转录系统的功能，使自身DNA大量复制同时合成大量的外壳蛋白，并组装成大量(约100个)完整的噬菌体颗粒，最后，使宿主裂解并从细胞中释放出来。
在溶源周期中，λ噬菌体的DNA分子进入宿主后并不马上复制，而是在特定的位点整合到宿主染色体DNA中，与宿主染色体形成一体，并随宿主染色体的复制而复制，随宿主的分裂繁殖传给其子代细胞。
λDNA至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似性成簇排列。值得注意的是，在入λDNA分子中从J基因到N基因之间，大约占λDNA总长度三分之一的区段对于λ噬菌体的裂解周期而言是非必需的。这一区段的缺失或在此段插入外源DN***段，将不影响入噬菌体的增殖。这就是λ噬菌体可作为基因工程载体的一个重要的依据。
2．λ噬菌体载体
（1）改造
野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆的载体。主要原因有二：
①λDNA基因组大而且复杂，特别是其中具有许多基因克隆常用的限制酶识别位点(如5个BamHI位点、6个BglⅡ位点和5个EcoRI位点等)；
②λ噬菌体外壳只能接纳一定长度(即相当于入基因组大小的75％～105％)的DNA分子。因此，λDNA只能作为小片段外源DNA分子(即2．5kb左右)的克隆载体。这一克隆容量显然不能满足大多数基因克隆工作的要求，必须对野生型λDNA进行改造。
扩充λDNA载体的克隆容量是改造λDNA的首要目标；此外改造工作还包括：①除去裂解周期所必需的基因区域中的限制酶识别位点，在非必需区引入合适的限性酶位点；②引入适当的选择性标记以方便重组子的筛选；⑧通过在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体，以利于生物学防护等。
（2）载体类型：
只具有一个限制酶位点可便于外源DNA插入的称为插入型载体，含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DN***段所取代的载体称为取代型载体。
随着体外包装技术和寡聚核苷酸合成技术的发展，人们已经构建了许多带有多克隆位点的λ噬菌体载体，现在常规使用的λ噬菌体载体，不少既可用作插入型又可用作置换型。总之，多克隆位点的引入不仅极大地扩展了λ噬菌体的克隆范围，同时还大大地简化了其操作技术。
（3）重组体的筛选
λ噬菌体是利用插入失活或噬菌斑形成的原理筛选重组体的。常用的插入失活方法有大肠杆菌β—半乳糖苷酶失活和免疫功能失活两种。
利用β—半乳糖苷酶插入失活的载体(如λgt ll、λgt l8—23等)，在生色底物(X—gal)和诱导物(1PTG)存在时，与相应的Lac—宿主铺平板可形成深蓝色噬菌斑。用这种载体进行克隆时，β—半乳糖苷酶基因的大部分被外源DN***段取代，所产生的重组噬菌体丧失α—互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色噬菌斑。因此，对于这类入噬菌体载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。
在免疫功能插入失活型载体的基因组中与免疫功能有关的DNA区段中含有一、二种限制酶的单一切点，当外源DN***段由这些位点插入时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭到破坏，而无法进入溶源周期。因此，凡带有外源DN***段的重组体只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本则形成混浊的噬菌斑，不同的噬菌斑形态可作为筛选重组体的标志。这种类型的载体中的λgtl0最为常用。
3．λ噬菌体载体的应用
λ噬菌体作为克隆载体主要用于：
（1）基因组DNA文库的构建；
（2）cDNA文库的构建
（3）大容量载体(如粘粒等)中增殖的大片段外源DNA序列的亚克隆等。
四、 粘粒载体（柯斯质粒载体）
1．柯斯质粒载体的构建
λ噬菌体克隆外源DNA的能力，虽说其理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右。当然，在一般的情况下，这样大小的DN***段已足够容纳一个完整的基因及其两端的侧翼序列(flankingsequence)。然而，大量的研究资料表明，许多基因的分子大小比正常预期的要大得多，有的可达35～40kb甚至更大。同时，应用λ噬菌体作载体，还往往不能够同时克隆两个连锁的基因。不言而喻，在实际的研究工作中，特别是有关真核基因的结构与功能的研究，需要比λ噬菌体载体具有更大克隆能力的新型的载体。1978年，J．Collins及B．Hohn等人发展出的柯斯质粒载体(eosmidvectors)满足了这样的需要。
“cosmid”一词是由英文“cos site-carrying plasmid"缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点(cos)的质粒。因此我们说，所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有且DNA的COS序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。它们兼具有λ噬菌体的高效感染能力和质粒易于克隆选择的优点，既能像质粒一样在寄主细胞内复制，也能像λDNA一样被包装到噬菌体颗粒中去。其克隆能力为31—45kb，而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。
2．柯斯质粒载体的特点
目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体，柯斯载体的特点大体上可归纳成如下三个方面：
第一，具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对立噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的柯斯质粒DNA分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起来。但由于柯斯质粒载体并不含有且噬菌体的全部必要基因，因此它不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。
第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记，其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。例如，在pHC79柯斯质粒基因组的PstI限制位点克隆，会导致ampr基因的失活；在BamHI和SalI限制位点克隆，又会造成tetr基因的失活。
第三，具有高容量的克隆能力。正如上面所述，柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和COS位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右。因此，可以插入到柯斯质粒载体上并能被包装成立噬菌体颗粒的最大外源DN***段，即柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。这个数字比且噬菌体载体及质粒载体的最大克隆能力都要大得多。同时，由于包装限制的缘故，柯斯质粒载体的克隆能力还存在着一个最低极限值。如果用作克隆载体的柯斯质粒的分子为5kb，那么插入的外源DN***段至少得有30kb长，才能包装形成具感染性的且噬菌体颗粒。由此可见，柯斯质粒克隆体系用于克隆大片段的DNA分子特别有效。
目前，已有多种柯斯质粒载体可用于基因克隆，图所示为最常用的柯斯质粒载体之一pJB8。
粘粒载体功能与λ噬菌体类似，但由于λ噬菌体具有较大的多功能性和较高的克隆效率，仍然是目前构建基因文库时首选的克隆载体，粘粒载体只有在以下两种特定的情况下使用：①在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因；②克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段，即当载体克隆容量大具有明显优势时使用粘粒载体。
我查的
‘柒’ 根据目的基因构建重组质粒的步骤
（1）用限制酶将质粒切割开形成黏性末端，用DNA连接酶将目的基因与质粒连接起来． （2）质粒的实质是环状DNA，基本组成单位是脱氧核苷酸；由图中限制酶切割位置可知，目的基因插入的位置是氨苄青霉素抗性基因中． （3）步骤③是基因工程第三步：将目的基因导入大肠杆菌（受体细胞）．为了促进该过程，用Ca 2+ 处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞． （4）培养基C是选择培养基，培养基中有四环素，专一筛选含四环素抗性基因的大肠杆菌，能在C中生长的大肠杆菌有两种，分别是含有抗四环素基因、同时抗四环素基因和含氨苄青霉素基因的大肠杆菌． （5）D培养基中大肠杆菌能抵抗四环素和含氨苄青霉素，而E中只抗一种四环素，所以在E中对应区域（D中没有菌落的部位），该处为转基因大肠杆菌，结果如图： 故答案为： （1）限制酶 DNA连接酶 （2）脱氧核苷酸 氨苄青霉素抗性 （3）将重组质粒（目的基因）导入大肠杆 菌（受体细胞） Ca 2+ （4）2 （5）E 如下图所示（两点全圈出给分）． （1）限制酶 DNA连接酶 （2）氨苄青霉素抗性 （3）将重组质粒导入大肠杆菌（受体细胞） Ca 2+ （4）含四环素抗性基因的大肠杆菌 2 （5）E
‘捌’ 目的基因与载体的连接产物涂布于平板后由什么筛选出转化子/非转化子
用于基因工程的许多质粒载体含有编码抗生素抗性的基因，如pBR322携带有氨苄青霉素抗性基因（amp）和四环素抗性基因（tet）。这些基因作为载体的标记，其中一个（如amp）可以用来选择转化子。因转化子能在含有抗生素的琼脂糖培养基上形成菌落，而非转化的细胞被杀死。另一个基因（如tet）可以用作重组的质粒载体的标记，因为目标序列插入此基因导致插入失活。因此，用重组质粒转化的细胞仅对amp有抗性，而环状（天然）质粒转化的细胞对amp和tet都有抗性。
区分这两类转化体的一种方法是使用复制平板：
转化体首先放在含氨苄青霉素的琼脂培养基的培养皿上生长，过夜培养后，两种类型的细菌均会产生单一的菌落。
2. 将一张无菌茸板轻轻压在培养皿表面，使一些细胞转移到板上。
3. 将板上的细菌接种在含有四环素的琼脂培养基上（即一个复制平板）：任何仅能在第一个平板上生长的菌落一定来源包含有重组质粒的细胞。这些菌落可用于筛选特定的目的DNA（如使用免疫技术）。
PUC系列质粒比pBR322系列质粒的应用更广泛，这种质粒具有以下优点：
拷贝数：每个细菌细胞中存在着几千个相同拷贝的质粒，提高了质粒DNA的产量。
2. 重组子的“一步选择”：这种质粒携带有氨苄青霉素抗性基因，并在β-半乳糖核苷酶的基因含有一个多克隆位点。β-半乳糖核苷酶基因的插入失活可以被包含有一种合适的酶诱导物（如异丙醇基硫代半乳糖苷）和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（Xgal）的琼脂培养基检测到。来源于有质粒的细胞的菌落呈蓝色，而含有重组分子的菌落呈白色。另有一些质粒使用不同的标记物，如荧光素酶基因可以在荧光素底物的存在下通过生物发光检测到。